光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)及其影響

　   自荷蘭博物學(xué)家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀(jì)次將光線通過透鏡聚焦制成光學(xué)顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學(xué)家從事研究工作、探尋生命奧秘的利器。正是因?yàn)橛辛薒eeuwenhoek的這項(xiàng)偉大發(fā)明及其后繼者對(duì)顯微鏡技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，人們才能夠?qū)?xì)胞內(nèi)部錯(cuò)綜復(fù)雜的亞細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)有了初步的了解。

      此后，研究人員對(duì)顯微鏡技術(shù)的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細(xì)胞內(nèi)部更細(xì)微的結(jié)構(gòu)。近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報(bào)道的超高分辨率成像技術(shù)(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進(jìn)行觀察研究。

　　SR技術(shù)的發(fā)展過程

　　在達(dá)到今天SR技術(shù)水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動(dòng)的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

       在以上這些光學(xué)SR成像技術(shù)中有兩種技術(shù)——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)。

　　近，基于探針SR成像技術(shù)的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團(tuán)隨機(jī)激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經(jīng)取得了成功。

　　通過基于探針的SR成像技術(shù)，可以獲得多張?jiān)紙D像。在每一張?jiān)紙D像中，細(xì)胞內(nèi)只有一部分被熒光標(biāo)記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會(huì)受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點(diǎn)太密以至于無法成像的結(jié)構(gòu)的分辨率達(dá)到納米級(jí)水平，而且成像的分子密度也相當(dāng)高，可以達(dá)到105個(gè)分子/μm2。

　　這種分辨率對(duì)于生物學(xué)家來說，意味著現(xiàn)在可以在分子水平上觀察細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)過程了。

       雖然顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學(xué)家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗(yàn)結(jié)果互相參照，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。人們需要認(rèn)清SR顯微鏡的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)，為操作以及判斷SR圖像制定出標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范，只有這樣才能大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

　　現(xiàn)在，由于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)各組份的組織結(jié)構(gòu)以及它們的動(dòng)態(tài)變化過程都只有一個(gè)概念上的認(rèn)識(shí)，因此，借助顯微鏡從納米水平上對(duì)這些結(jié)構(gòu)及過程進(jìn)行真實(shí)的觀察能讓人們發(fā)現(xiàn)許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架是由大量絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成時(shí)，就有人對(duì)此現(xiàn)象持懷疑態(tài)度。那些認(rèn)為細(xì)胞骨架是一種用來稀釋細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)濃湯這樣一種結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生物學(xué)家把這種觀測(cè)結(jié)果稱作僵化的人為試驗(yàn)結(jié)果。

　　除非的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗(yàn)結(jié)果都能證明細(xì)胞骨架是由大量的絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成的，否則還會(huì)有人持上述的懷疑觀點(diǎn)。不過已經(jīng)有其它的生化試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了早期的電鏡觀察結(jié)果是正確的。當(dāng)然新興的SR技術(shù)也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)結(jié)果予以佐證才有價(jià)值，同時(shí)還需要電鏡的輔助。因?yàn)殡婄R能提供納米級(jí)的觀察結(jié)果，這對(duì)于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測(cè)結(jié)果來說是價(jià)值的。

　　今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時(shí)，需要注意將會(huì)出現(xiàn)的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關(guān)的缺點(diǎn)及其目前的解決方法。

       近幾年，就如何處理圖像已經(jīng)有了非常嚴(yán)格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對(duì)于怎么處理SR圖像還沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數(shù)據(jù)在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細(xì)胞內(nèi)該分子有可能出現(xiàn)的任何地點(diǎn)都標(biāo)示出來了。而且只有被標(biāo)記的分子按照一定的標(biāo)準(zhǔn)(發(fā)出的光子數(shù))判斷它的確是一個(gè)單分子并且定位準(zhǔn)確之后才顯示出來。必須對(duì)獲得的圖像進(jìn)行這樣的標(biāo)準(zhǔn)化處理之后才能分析結(jié)果。同樣，對(duì)于試驗(yàn)數(shù)據(jù)也需要如此進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數(shù)目夠多，以致能達(dá)到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會(huì)影響SR顯微鏡的應(yīng)用，但由于存在這些問題，所以我們應(yīng)該時(shí)刻提醒自己，一定要仔細(xì)判讀、分析SR顯微鏡的圖像結(jié)果，只有這樣才能得到有價(jià)值的生物學(xué)結(jié)論。

       SR熒光顯微鏡在生物學(xué)研究中的應(yīng)用

　　到目前為止，人們還很難得知，SR熒光顯微鏡會(huì)對(duì)生物學(xué)界的哪一個(gè)領(lǐng)域帶來重大變革，但已經(jīng)有幾個(gè)領(lǐng)域出現(xiàn)了明顯的改變。這些研究領(lǐng)域是動(dòng)態(tài)及靜態(tài)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域、非均質(zhì)分子組織研究領(lǐng)域、蛋白動(dòng)態(tài)組裝研究領(lǐng)域等。這幾個(gè)領(lǐng)域都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，那就是它們研究的重點(diǎn)都是分子間如何相互作用、組裝形成復(fù)合物。因此，能在納米水平觀察這些分子對(duì)它們來說具有重大的意義。

　　通過觀察蛋白質(zhì)之間的組合關(guān)系來了解它們的作用，并能為后續(xù)的細(xì)胞功能試驗(yàn)打下基礎(chǔ)

　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究在這方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4-8納米大小的分子間相互作用組裝成細(xì)胞微管、肌絲、中間絲這些超過10微米大小聚合物的機(jī)制。不過對(duì)于核孔復(fù)合體、中心體、著絲點(diǎn)、中間體、粘著斑這些由許多不同蛋白經(jīng)過復(fù)雜的三維組裝方式組合起來的復(fù)合體，還需要更好的辦法來進(jìn)行研究。目標(biāo)就是要達(dá)到分子水平的分辨率，這樣就可以觀察大復(fù)合體形成過程中的單個(gè)分子，也就能對(duì)這些分子的化學(xué)計(jì)量學(xué)有所了解了。要得到更多的生物學(xué)信息就需要SR顯微鏡這樣的三維成像技術(shù)，例如可以使用活體細(xì)胞SR成像捕捉細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重構(gòu)過程等等。

　　SR成像有助于人們更好地了解分子間的差異

　　細(xì)胞膜蛋白組織方式的經(jīng)典模型已經(jīng)從隨機(jī)分布的液態(tài)鑲嵌模型轉(zhuǎn)變成了脂筏模型、穴樣內(nèi)陷模型或特殊蛋白模型。這種差異與細(xì)胞不同功能相關(guān)，例如在高爾基體、cargo蛋白和高爾基體酶蛋白之間必須發(fā)生相互作用，但終它們會(huì)按照各自的功能分開，發(fā)揮各自的作用。有很多試驗(yàn)手段，例如免疫電鏡技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)等都已經(jīng)被用來研究這種膜不均一性問題了。多色PALM技術(shù)(Multicolor PALM)為人們提供了一種新的手段用來觀察膜蛋白集合、組織的過程，并且還能定量分析不同蛋白間的空間距離關(guān)系。因?yàn)橛辛薖ALM提供的單分子信息，人們就可以清楚地了解蛋白分子間的空間關(guān)系，甚至有可能計(jì)算出相隔某一距離的分子之間發(fā)生相互作用的可能性。這種方法除了用于研究膜蛋白之外，還能用于許多非隨機(jī)分布的生物系統(tǒng)研究，例如研究微管上的馬達(dá)蛋白。

　　SR成像技術(shù)還能用于在單分子水平研究蛋白動(dòng)態(tài)組裝過程

　　細(xì)胞對(duì)外界刺激信號(hào)的反應(yīng)起始于胞膜，在胞膜上受體蛋白之間發(fā)生動(dòng)態(tài)的集合，用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)活性。像HIV這種有被膜病毒也是在細(xì)胞膜上完成病毒顆粒組裝過程的病毒，也是利用了細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。盡管現(xiàn)在蛋白組裝的物理模型還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成，但研究人員知道膜蛋白的動(dòng)態(tài)組裝過程是不均一的，所以通常使用熒光試驗(yàn)手段很難獲得分子水平上的信息。同樣，單分子測(cè)量技術(shù)(Single molecule measurements)也存在著類似的局限，因?yàn)閱畏肿訙y(cè)量技術(shù)只能觀察細(xì)胞內(nèi)的幾個(gè)分子，所以缺乏整體的信息。因此由于缺乏空間分辨率，很難動(dòng)態(tài)地研究蛋白質(zhì)組裝過程。SR熒光成像技術(shù)與活細(xì)胞成像技術(shù)和單分子示蹤技術(shù)(sptPALM)結(jié)合就能解決這一問題。我們可以借助分子密度準(zhǔn)確地看出PALM圖像中的蛋白質(zhì)簇，蛋白質(zhì)簇動(dòng)態(tài)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)能幫助我們了解蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)組裝的機(jī)制。